荧光定量PCR(qPCR)问题汇总

背景校正程序用于测量定量PCR仪所用反应管和水的空白荧光强度。在10分钟内，仪器连续读取背景校正板的荧光强度，温度为60°C。软件计算平均值，用于从实验数据中扣除背景信号。推荐每三个月到半年校正一次，以防因污染、反应板、水纯度变化等因素影响信号强度。

**无扩增曲线**：这可能是因为荧光信号采集设置不当，确保在 72℃ 延伸阶段或退火延伸步骤正确设置信号采集。此外，引物降解和模板浓度低也可能导致此问题，可通过 PAGE 电泳检验引物完整性和增加模板量解决。 **扩增曲线不光滑**：长时间未校准的仪器可能引起波动，建议定期校准。

Real Time PCR （qPCR） 是一种利用荧光染剂实时检测每次 PCR 循环后产物总量的分子生物学技术。qPCR 是 PCR 的衍生反应，以其灵敏、特异、精确和使用简便的优点，在分子生物学研究中被广泛应用。本文将对 qPCR 常见问题及解决方案进行详细介绍。

实时荧光定量PCR（qPCR）技术作为分子生物学研究的关键工具，在众多生物学研究中得到广泛应用。然而，操作不当往往导致数据精度低、重复性差及可信度问题。本文旨在优化qPCR实验操作与数据分析，以提升实验结果的准确性和可靠性。优化qPCR实验操作与数据分析，首先需重视引物设计。

赛默飞世尔科技(中国)有限公司的重点市场

赛默飞通过先进的空气质量监测技术，操作简便和性能可靠的监测仪器，高效稳定的系统，能开展气体检测和温室气体分析。

此外，赛默飞世尔还拥有丹麦Proxeon、Forma Scientific、Heraeus、Revco和Labsystems等实验室通用设备和耗材，如Nunc和Nalgene的细胞培养相关设备，Shandon和Microm的病理实验室设备，Oxoid和Remel的微生物产品。最后，Fisher Scientific的实验室设备、家具和各种耗材也构成了赛默飞世尔科技品牌组合的重要部分。

赛默飞世尔科技在中国的业务发展迅速，其中国团队已超过千人，专注于制造和销售相关产品与服务。总部位于繁华的上海，同时，公司在中国的其他重要城市如北京、广州、香港、成都和沈阳也设有分支机构，形成了一张广泛的业务网络。

年1月17日，赛默飞世尔科技在苏州科技城医疗器械产业园投资建设的新工厂正式签约，计划打造成亚太地区最大的实验室耗材和实验设备生产基地，包括酶标板、细胞培养用品、二氧化碳培养箱等。二期工程还将建设研发中心和区域流通总部，进行实验室器材的组装与测试。

如何通过qpcr看一个基因的表达丰度

1、由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。

2、扩增过程：使用qPCR仪对PCR反应进行数轮扩增，扩增曲线中根据扩增产物的拷贝数与相关基因的相对丰度呈正比关系，多次扩增后产生的曲线在最后一个扩增周期称为CT值。

3、扩增曲线异常是RT-qPCR实验中常见的问题，包括Ct值偏大、无平台期、平台期下降等。Ct值偏大，通常意味着模板量低或基因表达丰度低。解决方法有增加模板量，观察Ct值是否相应减小；检查反应条件和引物设计是否适宜；确保扩增产物长度不超过300bp，避免体系中存在抑制剂影响酶活性。

4、他们利用qPCR检测了tRNAUUA的表达丰度。在使用依托泊苷处理细胞后，他们检测到细胞核和胞质中的tRNAUUA丰度均显著降低，因此，丰度的降低可能阻止了它与核糖体的及时结合，导致了这种延迟，进而导致整体翻译的下降。

5、芯片实验的优势在于它们很快，相对廉价，且数据存储和处理较为轻松。在很短的时间内可生成两个样品之间差异表达基因的列表，并用于指导通路、基因本体、网络/互作组的分析，为两个样品之间的生物学差异提供线索。这也可以通过测序来实现，但过程稍微复杂一些。如果要研究选择性剪接，那么无疑要选择测序。

qPCR那点事儿!

Real-time qPCR的数学原理：Ct值、阈值和基线是Real-time qPCR中的重要参数。第3-15个循环的荧光值是基线，由于测量偶然误差引起。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。Ct值是荧光值达到阈值时的PCR循环次数。

内参基因的验证与优化在选择内参基因后，确保其稳定性的验证至关重要。常用工具如geNorm、BestKeeper、NormFinder和RefGenes可以帮助我们评估候选基因的稳定性。首先，可以选取多个候选基因，然后通过qPCR实验进行深入比较，关注每个基因的Ct值平均值和标准偏差，以此来确定最稳定、最适合实验需求的内参基因。

在[qPCR 专栏]系列文章中，我们探讨了相对定量方法的应用，特别是在无需绝对定量时，它在分析样本间基因表达变化中的重要性。相对定量通过将样本的表达量与内参基因（如管家基因）进行比较，来衡量目的基因的相对表达水平。内参基因的选择至关重要，它们通常作为稳定表达的参照，用来校正实验误差。

接下来，我们介绍核酸提取的基本步骤：裂解细胞，释放核酸。使用裂解液破坏细胞结构，释放核酸至裂解体系。分离纯化核酸。去除与核酸结合的蛋白质、多糖、脂类等，以及不必要的核酸分子。核酸浓缩与沉淀。通过操作使核酸浓度提高，形成沉淀。纯化核酸。将核酸与裂解体系中的其他成分彻底分离。

定量方法知多少--绝对定量

1、绝对定量是通过样品的Cq值和标准曲线进行比较实现的。首先为了建立标准曲线，需要已知拷贝数浓度的标准品，对标准品进行5次以上的连续梯度稀释，将稀释的标准品进行实时荧光定量PCR扩增，最后根据各样品的拷贝数浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0+b，其中X0为起始模板量。

2、需要运用定量方法检测确定内参。实时荧光定量PCR的定量方式有两种：绝对定量：如检测人血液中HBV病毒的绝对数目等。这需要有标准品首先做一个直线。然后再检测你的样品来绝对定量。相对定量：相对定量需要做内参，除了B-actin，其他的像GAPDH也可以的。

3、绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

4、相对定量：是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

5、每mol的微粒数）是02e+23/mol。那么每2μl的绝对模板数量是：=14e+10所以，10-4~10-7质粒的模板分子数是14e+6~3。简单的说：每ul质粒拷贝数=（质量/分子量）x（0e+23）=[质粒浓度（ng/ul）x1ul]x10-9/[（质粒分子量+插入片段分子量）x660]x（0e+23个/mol）。

如何作QPCR的标准曲线

1、构建标准曲线在qPCR绝对定量中扮演关键角色。步骤如下：首先准备标准样品，通过从已知浓度的DNA或RNA模板制备一系列不同浓度的稀释样本。接着设计引物和探针，确保其特异性结合目标序列，并在PCR反应中产生可信赖信号。进行qPCR反应，使用准备的样本记录荧光信号变化。

2、作QPCR的标准曲线可以用PCR－ELISA法作。具体如下：PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合；再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

3、构建标准曲线的一般步骤包括选择合适的标准品、精确定量标准品、制作标准品稀释液、进行qPCR扩增、收集荧光数据和绘制标准曲线。合格的标准曲线应具备高相关系数和理想的扩增效率。在执行QPCR实验时，应注重标准品的选择、定量、稀释以及实验过程中的污染控制、重复性以及遵循标准操作流程。